Циркадианные ритмы (Нобелевская премия 2017)

Циркадианные ритмы (Нобелевская премия 2017)

By Евдокия Цветкова|17/10/2017|Новости

В 2017 году Нобелевская премия по Медицине и Физиологии была вручена докторам Джеффри К. Холлу (Университет Мэн, Ороно), Майклу Росбашу (Университет Брендейс, Валтам, Массачусеттс) и Майклу Янгу (Университет Рокфеллера, Нью-Йорк Сити) за их открытия молекулярных механизмов, контролирующих циркадианные ритмы.

По словам Королевской Шведской Академии Науки, открытие лауреатов позволило установить ключевой механизм работы биологических часов [1].

Ключевой особенностью всего живого на Земле является способность адаптироваться к окружающей среде. В разных географических зонах организмы адаптируются к условиям, преобладающим в их местоположении, для повышения выживаемости. Однако в любом месте ежедневно происходят изменения в освещении и температуре в результате вращения Земли вокруг ее оси. Чтобы адаптироваться к таким изменениям, организмы разработали внутренние биологические часы, которые адаптированы к дневным и ночным циклам и помогают им оптимизировать свою физиологию и поведение. Этот внутренний ежедневный ритм известен как «циркадианный», от латинских слов. Циркадианные ритмы являются эволюционно древними и сохраняющимися на протяжении многих стадий филогенеза. Известно, что они существуют у одноклеточных цианобактерий и простейших и всех многоклеточных организмах, включая грибы, растения, насекомых, грызунов и людей. Блоки циркадианной системы состоят из:

  • автономного 24-часового генератора ритма, или осциллятора;
  • механизмов, называемых zeitgebers (то есть секундомер), которые связывают осциллятор с внешними стимулами, такими как свет;
  • выходного механизма, обеспечивающего своевременное планирование физиологических процессов.

От ритма до часов

То, что организмы приспосабливают свою физиологию и поведение ко времени суток было отмечено давно. Примером могут служить наблюдения за движениями листьев и цветов растениях. Например, листья растений мимозы закрываются на ночь и открываются днем. В 1729 году французский ученый Жан Жак д’Ортус де Майран разместил растение мимозы в темноте и заметил, что листья все еще открываются и закрываются ритмично в соответствующее время суток, что указывает на эндогенное происхождение суточного ритма (рис. 1).

Рисунок 1. Эндогенные биологические часы. Листья растений мимозы открываются в дневное время и закрываются в сумерках.

Около двухсот лет спустя немецкий физиолог, физик и пионер исследования суточного ритма Эрвинг Бьюннинг связал листья растения бобов с кимографом и оценил движения листьев в естественном цикле “день-ночь” и при искусственном освещении. Он заметил, что ритм движения листьев сохраняется и при постоянном освещении. Вопрос о том, регулировалось ли циркадианное поведение растений и животных эндогенными часами или являлось простой реакцией на внешние раздражители суточного характера, обсуждался десятилетиями. В конце концов, существование эндогенных циркадианных часов, было установлено.

Наследование циркадианных ритмов и генов

С течением времени была выявлена циркадианная ритмичность многих физиологических параметров помимо периодических движений листьев, и наследование циркадианных ритмов стало рассматриваться как продукт естественного отбора. Классические исследования Эрвинга Бьюннинга в 1930-х годах показали, что циркадианные ритмы в растениях могут быть унаследованы, несмотря на то, что родительские растения подвергались воздействию нециклических световых периодов. Также было показано, что скрещивание штаммов с различными циркадианными ритмами дает растения с промежуточным вариантом ритмов. К середине 1960-х годов было сформировано устойчивое сообщество исследователей хронобиологии, изучающих биологические часы, и стала рассматриваться концепция CLOCK-генов.

Примерно в это же время Сеймур Бензер и его ученик Рональд Конопка, работавшие в Калифорнийском технологическом институте, приступили к исследованиям по выявлению мутантных плодовых мошек с измененными циркадианными фенотипами. В отличие от некоторых генетиков и бихевиористов того времени, Бензер твердо верил, что на конкретный аспект поведения может влиять действие конкретных генов и что это можно будет продемонстрировать, изолируя особи с измененным поведением, связанным с мутациями в отдельных генах. Используя классическую стратегию мутагенеза, основанную на действии химических веществ, Бензер и Конопка выделили три разных штамма мутантных мух, демонстрируя изменения в нормальном 24-часовом цикле моторной активности и окукливания (Konopka and Benzer, 1971). Один штамм был аритмичным, другой имел периодичность менее суточной — 19 часов, а у третьего была более длительная периодичность в 28 часов. Картирование с использованием известных в то время генетических маркеров  локализовало мутации всех трёх штаммов в одну и ту же область Х-хромосомы плодовой мошки. Важно отметить, что тесты предполагали, что три мутации затрагивают один и тот же ген, позже названный периодическим (PER). Исходя из этого, Бензер и Конопка предсказывали, что аритмический штамм имеет нонсенс-мутацию, которая полностью инактивирует ген, а штаммы с более длинными и короткими периодами имеют миссенс-мутации, которые каким-то образом изменяют функцию продукта гена в противоположных направлениях. Позже работа показала, что прогнозы были правильными. Хотя Бензер сменил сферу научного интереса, Конопка продолжил работу над локусом PER, с большей точностью отображая его хромосомное положение. Однако ген периода не был бы молекулярно клонирован и секвенирован до середины 80-х годов. И только в работе Джеффри Холла, Майкла Росбаша и Майкла Янга (Bargiello and Young, 1984; Bargiello et al., 1984; Reddy et al., 1984; Zehring et al., 1984) был выделен первый тактовый ген и его структура была молекулярно охарактеризована. Однако ни генетическая идентификация PER, ни клонирование и секвенирование его ДНК не объясняли молекулярный механизм циркадианных часов.

Петля обратной связи транскрипции-трансляции (The Transcription-Translation Feedback Loop, TTFL).

В годы, последовавшие за выделением PER, было предложено несколько моделей, объясняющих, как белок per может создавать циркадианные колебания. Была предложена модель «мембранного градиента», согласно которой per функционирует как насос и создает трансмембранный градиент, а при достижении порога рассеивается через светочувствительные каналы. Другая модель описывала белок PER как протеогликан, объединяющий клетки и облегчающий образование межклеточных щелевых соединений.

Наконец, произошла серия прорыв с использованием per-антител. Первым было открытие лабораторией Холла и Росбаша 24-часового цикла продукции белка per в нейронах головного мозга мух с пиком в ночные часы (Siwicki et al., 1988). Также были выявлена циркадианная зависимость содержания мРНК, кодируемой геном PER, в мозге мух, показывая, что циркадианный ритм секреции белка per является последствием циркадианного ритма экспрессии мРНК PER. Примечательным было то, что пик уровней мРНК PER наблюдался ночью, за несколько часов до пика секреции белка per (Hardin et al., 1990). При этом было обнаружено, что штамм с нонсенс-мутацией PER был неспособен поддерживать колебания уровня мРНК PER, но белок per особи, не подвергавшейся мутации, может вернуть циклическую экспрессию мРНК. На этих наблюдениях была построена модель саморегулирующейся отрицательная обратной связи, согласно которой накопление белка per приводит к ослаблению экспрессии мРНК PER (Hardin et al., 1990). Впоследствии было обнаружено, что белок per является ядерным белком и перемещается из клеточного ядра в цитоплазму на время, что свидетельствует в пользу идеи о том, что белок per является регулятором транскрипции (Liu et al., 1992).

Еще одним прорывом стало обнаружение Янгом еще одного гена, влияющего на циркадианные часы (Myers et al., 1995; Sehgal et al., 1995). В серии последующих экспериментов лаборатория Янга обнаружила, что мРНК TIM (timeless) также циклически повторяются с 24-часовым периодом и что TIM может напрямую связываться с PER, влияя на его ядерную локализацию и количество, посредством блока его деградации (Gekakis et al., 1995; Sehgal et al., 1994; Vosshall et al., 1994). Важно отметить, циркадианная цикличность экспрессии PER была нарушена у мух с мутацией в TIM, так же как и цикличность экспрессии TIM была нарушена у особей с мутацией в PER (Sehgal et al., 1994, 1995). Эти открытия укрепили основные концептуальные рамки TTFL как механизма, поддерживающего циркадианную цикличность в саморегуляции молекулярных часов (рис. 2). В то время механизм транскрипции не был очевиден, и, как уже отмечалось выше, рассматривались различные альтернативные модели. Таким образом, можно сказать, что открытие самоподдерживающейся циркадианной петли обратной связи транскрипции-трансляции явилось новой парадигмой.

Механизм, который активировал транскрипция PER и TIM, оставался неизвестным до открытия генов CLOCK (CLK) и CYCLE (CYC) (Allada et al., 1998; Rutila et al., 1998). Ген CLK был впервые идентифицирован у мышей Джозефом Такахаси (King et al., 1997). Продукты генов CLK и CYC взаимодействуют друг с другом, содержат базовые структурные компоненты (т.н. “спираль-петля-спираль”, basic helix-loop-helix, bHLH) и связываются с кодонами PER и TIM, тем самым положительно регулируя их транскрипцию. В последующих исследованиях было показано, что TIM и PER действуют как отрицательные регуляторы активности CLK, что  замыкает петлю обратной отрицательной связи (Darlington et al., 1998).

A)

B)

Рисунок 2. Схема регуляции обратной отрицательной связи гена PER. A)На рисунке показана последовательность событий в течение 24-часового цикла. Когда ген PER активен, происходит транскрипция мРНК PER. мРНК переносится в цитоплазму клетки становится матрицей для трансляции белка per. Белок per накапливается в ядре клетки и блокирует активность гена PER. Это является механизмом отрицательной обратной связи, который лежит в основе циркадианного ритма. B)Упрощенная иллюстрация молекулярных компонентов циркадианных часов.

Современные модели циркадианного механизма молекулярных часов очень сложны и включают в себя множество дополнительных компонентов, которые способствуют его устойчивости и циркадианной периодичности (Hardin, 2011). Важно отметить, что, поскольку реакции транскрипции и трансляции обычно очень быстрые, на основной механизм TTFL накладываются факторы задержки для генерации 24-часовых колебаний. Это достигается сложной сетью реакций с регулируемым фосфорилированием белков и деградацией компонентов TTFL, сборкой протеинового комплекса, ядерной транслокацией и различными посттрансляционными модификациями (Hardin, 2011). Ключевым наблюдением, демонстрирующим основополагающий механизм подобной задержки, стало открытие Янгом гена DOUBLETIME (DBT), кодирующего киназу, которая фосфорилирует PER и повышает время его деградации (Price et al., 1998). Дополнительные белки интегрируют влияние внешних стимулов на биологические часы. Например, свет активирует транскрипцию криптохромного гена CRY, белок-продукт которого связывается с TIM, что приводит к его деградации (Ceriani et al., 1999; Emery et al., 1998). Так, при наступлении утра, TIM деградирует, оставляя PER уязвимым для фосфорилирования dbt и последующей деградации.

Циркадианные часы других организмов

Механизм TTFL также является основополагающим для циркадианных часов других многоклеточных организмов, включая человека. Несколько гомологов основных циркадианных белков Drosophila, включая CLK и PER, играют аналогичную роль в циркадианном цикле млекопитающих (Papazyan et al., 2016).

Хотя растения в основном используют факторы транскрипции, не гомологичные тем, которые присутствуют в циркадианных часах Drosophila, TTFL и для них является объединяющим основным механизмом (Nohales and Kay, 2016).

Однако у цианобактерий был описан другой тип независимого от транскрипции циркадианного осциллятора, который зависит от последовательного фосфорилирования белка (Ishiura et al., 1998).

Примечательно, что циркадианный ритм может быть восстановлен in vitro с использованием очищенных часовых белков цианобактерий и АТФ (Nakajima et al., 2005). Цикличность, независимая от транскрипции, и вызванная перикисным окислением пероксиредоксина, также была описана у эукариот, в том числе — в эритроцитах человека (O’Neill et al., 2011; Ray and Reddy, 2016). Физиологическое значение таких TTFL-независимых колебаний неизвестно. Тем не менее, эти результаты свидетельствуют о том, что в клетках млекопитающих могут существовать дополнительные механизмы генерации циркадианных колебаний.

Синхронизация биологических часов

Циркадианный ритм регулируется как на центральном, так и на периферическом уровне. У млекопитающих центральный пейсмейкер расположен в супрахиазматическом ядре (SCN) гипоталамуса и функционирует как центральные циркадианные часы. Сетчатка получает фотосигнал и передает эту информацию в SCN, которое синхронизирует свои собственные нейронные часы. Центральные часы регулируют циркадианные ритмы по всему телу посредством гуморальных факторов и вегетативной нервной системы. Однако способность к экспрессии циркадианных генов есть у всего организма, и большинство периферических органов и тканей имеют циркадианные колебания даже в изолированном состоянии (Balsalobre et al., 1998). Таким образом, циркадианная система человека напоминает скорее часовую мастерскую, чем одни отдельные часы. Это поставило проблему эффективной синхронизации всех этих часов (Mohawk et al., 2012).

Периферические часы могут синхронизироваться как по SCN, так и по сигналам внешней среды, включая прием пищи, физическую активность и температуру. Периферические часы в разных тканях контролируют соответствующие физиологические параметры, такие как глюконеогенез, липогенез и высвобождение гормонов (Panda, 2016). Они, в свою очередь, функционируют как часовые сигналы в тканях организма, в конечном итоге возвращаясь к SCN. Таким образом, циркадианная система организма представляет собой сеть взаимосвязанных осцилляторов и контуров обратной связи. Отношения между центральным и периферическими часами и многочисленные способы воздействия на них внешних и внутренних сигналов — это область исследований, доступная для новых открытий.

Хронобиология и здоровье человека

Хронобиология влияет на многие аспекты физиологии человека. Например, циркадианные часы помогают регулировать фазы сна, пищевое поведение, высвобождение гормонов, артериальное давление и температуру тела (рис. 3). Молекулярные часы также играют важную роль во многих тканях. Удаление циркадианных генов на животных моделях приводит к аритмическому производству гормонов, таких как кортизол и инсулин (Son et al., 2008). Циркадианные гены также оказывают значимое влияние на метаболизм посредством контроля глюконеогенеза, чувствительности к инсулину и системных колебаний гликемии (Panda, 2016). Сон жизненно необходим для нормального функционирования мозга, а циркадианная дисфункция связана с расстройствами сна, а также с депрессией, биполярным расстройством, когнитивной дисфункцией, снижением памяти и некоторыми неврологическими заболеваниями (Gerstner and Yin, 2010). В редких случаях расстройства сна связаны с мутациями в циркадианных генах, что приводит к нарушению цикла “сон-бодоствование” (Patke et al.,2017; Toh et al.,2001). Исследования показали, что хроническое несоответствие между образом жизни и ритмом, задаваемым эндогенными циркадианными часами, может быть связано с повышенным риском различных заболеваний, включая раковые заболевания, нейродегенеративные заболевания, нарушение обмена веществ и воспалительные заболевания. Предпринимаются усилия по разработке фармакологических препаратов для изменения периода, фазы или амплитуды циркадианных часов для улучшения здоровья человека (Hirota and Kay, 2015).

Рисунок 3. Циркадианные часы влияют на многие аспекты физиологии человека. Эти часы помогают регулировать сон, пищевое поведение, высвобождение гормонов, артериальное давление и температуру тела. Большая часть генов регулируется молекулярными часами.

Заключение

Открытие саморегулирующейся петли обратной связи транскрипции-трансляции как центрального компонента механизма молекулярных часов, с помощью которого гены контролируют циркадианные колебания в клетках и тканях, привело к новой парадигме в нашем понимании того, как организмы адаптируются к циклу “день-ночь”. Благодаря этим открытиям трех лауреатов, разъясняющим фундаментальный физиологический механизм, циркадианная биология превратилась в обширную и динамично развивающуюся область исследований, которые затронут вопросы здоровья и благополучия всех нас [2].

Источники:

  1. https://www.nih.gov/news-events/news-releases/nih-grantees-win-2017-nobel-prize-physiology-or-medicine
  2. “The 2017 Nobel Prize in Physiology or Medicine — Press Release”. Nobelprize.org. Nobel Media AB 2014. Web. 2 Oct 2017.